protocole de coloration

- Réalisation du frottis Elle nécessite d'avoir un frottis fixé, la solution la plus simple est avec de l'éthanol durant 5 minutes (et rincer à l'eau), - Réalisation de la coloration 1.Coloration par le violet de gentiane. Laisser agir de 30 secondes à 1 minute. Rincer à l'eau déminéralisée. 2.Mordançage (fixation à l'aide d'un sel) au lugol (solution d'iode iodo-iodurée): étaler le lugol et laisser agir 20 secondes ; Rincer à l'eau déminéralisée. On peut réaliser une deuxième fois l'opération identiquement pour plus de sécurité. 3.Décoloration (rapide) à l'alcool (+acétone): verser goutte à goutte l'alcool ou un mélange alcool-acétone sur la lame inclinée obliquement, et surveiller la décoloration (5 à 10 secondes). Le filet doit être clair à la fin de la décoloration. Rincer sous un filet d'eau déminéralisée ; 4.Recoloration à la fuchsine. Laisser agir de 30 secondes à 1 minute. Laver doucement à l'eau déminéralisée. Sécher la lame sur une platine chauffante à 40°C, 10 à 15 minutes. 5.Observer avec une goutte d'huile à immersion objectif 100 (grossissement ×1000). L'étape 3 (alcool) sert à décolorer le cytoplasme des bactéries qui seront dites « Gram négatives ». En effet, celles-ci ont une paroi pauvre en peptidoglycanes - donc plus fine - qui va laisser passer l'alcool (molécule hydrophile) ou le mélange alcool-acétone, et qui décolorera le cytoplasme en éliminant le violet de gentiane. La recoloration à la fuchsine permet de les colorer en rose. Au contraire, pour les bactéries dites « Gram positif » la paroi constitue une barrière imperméable à l'alcool car elle est composée d'une « couche » de peptidoglycanes plus importante donc de ce fait ; plus épaisse. Elles resteront alors violettes.